光学显微镜的组织学样品制备

概述

组织学是一个术语,指的是组织和细胞的微观解剖学研究。正确的光学显微镜组织学样品制备对于从组织样品中获得高质量结果至关重要。

几乎所有组织学程序共有3个主要步骤。**先,固定样品,以保护组织并减缓组织降解。接下来,将样品浸入具有与其自身相似的机械性能的材料或包埋介质中。包埋后,使用称为切片机的精密切割工具将样品切成薄片或切成薄片。该视频介绍了这些常规步骤以及与之相关的一些概念。

组织样本固定

组织固定是保存细胞和组织成分并维持其结构的**步骤。细胞死亡后,天然存在的酶从细胞器中释放出来,并开始降解整个细胞和细胞外基质中的蛋白质,从而破坏了细胞的结构。固定通过直接抑制这些酶消化蛋白质的能力和使酶切位点无法识别来防止这种降解。

固定的两个主要机制是交联和凝结。交联涉及蛋白质内部以及蛋白质之间的共价键形成,这会导致组织变硬并因此抵抗降解。凝结是由于使用酒精或丙酮使蛋白质脱水而引起的,这会使蛋白质的三级结构变形,从而使疏水或担心水的区域移动蛋白质表面。凝结性固定可以帮助包埋石蜡等介质穿透组织。

**常用的固定剂之一是福尔马林,它是溶于水中的甲醛。在固定过程中,甲醛附着在伯胺上,例如在赖氨酸和谷氨酰胺氨基酸侧链上发现的那些,形成稳定的交联键,称为甲苯桥。此过程本质上很慢,**多可能需要1-2天。

固定之前,应考虑一些注意事项。**先,考虑样品的扩散率。固定剂将以与固定剂的扩散系数乘以时间平方根相关的速率在组织中扩散一定距离。固定剂需要1个小时才能穿透1毫米到样品中,将花费25个小时才能穿透5毫米。一旦福尔马林到达组织中心,就需要发生交联反应基石。因此,为了在合理的时间内彻底固定样品,样品的厚度应限制为4 mm。

其次,考虑固定剂的体积和pH值。固定剂与样品的体积比应至少为40:1,以使试剂不会随时间流逝。尽管某些固定剂的设计目的是在酸性pH值下工作,但福尔马林在磷酸盐缓冲液中保持中性pH值时效果**佳,因此不会产生过多的酸,从而在组织中造成假象。

嵌入和分段

组织学准备工作的下一步是嵌入,这涉及到在具有与标本本身相似的机械刚度的介质中支撑标本。选择正确的嵌入介质至关重要,因为如果它太硬或太弱,在切片时可能会出现缺陷。到目前为止,**常用于包埋的介质是石蜡。

在石蜡包埋之前,**先通过用乙醇代替组织中的水使样品脱水,然后再用二甲苯和二甲苯,**后加热石蜡。蜡渗入样品后,将其小心放置并使用模具将其包围以形成块。接下来,将样品附着到组织盒上进行切片。

切片是从嵌入块中切割样品薄片的过程。切片通常为4-10 µm厚,可用于光学显微镜

要切割切片,**先将金属,玻璃或金刚石刀片固定在切片机上。然后将样品放在样品架中。接下来,将样品推进到切割表面并在刀片上拉出,以形成所需厚度的切片。切片将积聚成薄带,可以放在载玻片上。

切片后,将样品放在载玻片上。对于石蜡包埋的样品,**先将切片放入温水浴中,然后将其从水中提起至载玻片上,然后干燥。

应用

生物组织的固有对比度很小,因此在组织学检查后,玻片通常会用​​突出形态或特定蛋白质的染料或抗体染色。进行的**常见的染色是苏木精和曙红或H&E。因为它是如此普遍,所以已经制造出许多自动机器,用H&E对许多部分进行可重复染色。苏木精将细胞核染成蓝色,曙红将细胞质染成粉红色,显示出组织的细胞形态。

固定的一个缺点是蛋白质的交联可以使其更多地用于标记抗体以找到其结合位点。可以使用组织的快速冷冻或速冻,而不是使用固定来保存样品,然后使用称为冷冻切片的切片技术

将组织样品包埋并定向在称为OCT的特殊冷冻介质(或**佳切割温度介质)中,然后快速冷冻。像其他嵌入介质一样,OCT与样品的刚度匹配。

冷冻切片机或低温恒温器用于切割冷冻切片,并且该仪器将内部温度保持在-20°C,以使切割刀片和样品保持凉爽。与石蜡包埋的切片相比,切片后可以将冷冻切片直接直接举到带正电的载玻片上。

避免固定的另一种方法是通过琼脂包埋,即用新鲜制备的液体琼脂糖覆盖样品。当琼脂糖冷却时,它将组织锁定在适当的位置,多余的琼脂糖可以修剪掉。

切片机是切片机的另一种选择,它具有一个刀片,可以振动并在琼脂糖包埋的样品上移动。切片刀用于从琼脂糖包埋的样品中产生约50-1000 µm的厚切片。

通常在染色前将样品从琼脂糖中取出,然后放在载有诸如真空油脂等物质包围的载玻片上,以防止盖玻片挤压样品。**好使用共聚焦显微镜对其进行观察,以获得每个厚切片的高分辨率图像。