荧光显微镜简介

荧光显微镜介绍

荧光是物质吸收给定波长的光并发射另一波长的光时发生的现象。荧光发生于电子,该电子被激发到更高且更不稳定的能量状态,弛豫到其基态并发出光子。负责激发或将电子移动到更高能量状态的光,其波长和能量要比荧光发射的波长和能量长,而荧光发射的波长更长,能量更低且颜色不同。

荧光显微镜结合了光学显微镜的放大特性和荧光技术,该技术可以激发和检测荧光团-荧光化合物的发射。借助荧光显微镜,科学家可以观察组织内特定细胞类型或细胞内分子的位置。

荧光显微镜的原理和组成

荧光显微镜的主要组成部分与传统的光学显微镜有很大的重叠。但是,两个主要区别是光源的类型和专用滤镜元件的使用。

荧光显微镜需要一个非常强大的光源,例如氙气或汞弧光灯,如此处所示。水银弧光灯发出的光的亮度是大多数白炽灯的10到100倍,并提供从紫外线到红外线的各种波长的光。此高功率光源是荧光显微镜设置中**危险的部分,因为直视未过滤的光会严重损坏视网膜,如果灯泡处理不当会导致灯泡爆炸。

荧光显微镜的基本原理

荧光显微镜的原理很简单。当光离开弧光灯时,它被引导通过一个励磁滤波器,该滤波器选择激发波长。

该光被称为二向色镜的特殊镜向样品反射,该镜被设计为仅反射激发波长的光。反射光穿过物镜,然后将其聚焦到荧光样本上。样品发出的光又依次通过物镜-发生图像放大的物镜-现在通过二向色镜。

该光被屏障过滤器过滤,屏障过滤器选择发射波长并过滤掉来自弧光灯或其他从显微镜组件反射回来的光源的污染光。**终,过滤后的荧光发射被发送到检测器,在此图像可以被数字化,或者被传输到目镜进行光学观察。

激发滤光片,二向色镜和屏障滤光片可以组装在一起,成为一个称为滤光片立方的组件。观察样品期间可以改变不同的滤光片立方体以改变激发波长,并且可以使用一系列的隔膜来改变激发强度。

在进行荧光显微镜检查时,荧光团与显微镜本身一样重要,并且要成像的荧光团的类型决定了所用的激发波长和所检测到的发射波长。激发波长包含能被荧光团吸收并使其转变为激发态的小范围能量。激发后,可能会产生大范围的发射或转换回较低的能量状态,从而产生发射光谱。

吸收或激发曲线的峰值与发射曲线的峰值之间的差称为斯托克频移。该偏移的距离越大,则将两个不同的波长分开就越容易。此外,滤镜立方体的组件需要去除任何重叠的光谱,以减少背景并提高图像质量。

荧光团长时间处于激发状态会导致其发生光漂白,这是荧光减弱或丢失的原因。为了减少光漂白,您可以在幻灯片上添加防褪色安装介质,并用指甲油密封边缘。幻灯片在不成像时也应保持在黑暗中。

荧光显微镜成像

要开始荧光成像,请打开氙气或汞灯光源,并使其预热15分钟,以使其达到恒定的照明度。

接下来,将您的样品放在舞台上并将其固定到位。然后,打开显微镜的白光源。通过调节粗调和细调旋钮,使用**低功率的物镜将样品聚焦。然后,使用舞台调节旋钮找到您感兴趣的区域。

接下来,关闭白光源以及所有不必要的室内灯以减少背景。

为要成像的染料选择正确的滤镜立方体,然后打开快门以照亮样品。

**后,进行微调焦,并将输出光引导至成像相机。您可能需要调整每种使用的不同荧光团或荧光染料的曝光时间。但是,比较不同样品上具有相同染料的特征时,保持曝光时间恒定很重要。

要使同一样本上的多种染料成像,请更改滤镜立方体以匹配每个荧光团并记录新图像。

对样品中的每种染料成像后,可以叠加并合并各个图像。

应用

许多不同类型的实验都可以利用荧光显微镜检查,并涉及不同类型的荧光团。荧光显微镜检查的**常见应用之一是对已用与荧光化合物连接或“缀合”的抗体标记的蛋白质进行成像。在此,使用与alexafluor-488偶联的二抗检测了针对钩端螺旋体表面蛋白的抗体,该抗体在激发时发出绿色荧光。

用荧光突出显示特定特征的另一种方法是将荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白或GFP)的代码整合到生物体的DNA中。GFP的基因**初是从水母中分离出来的,可以由培养的细胞表达或产生,以响应特定的触发信号或作为特定细胞类型的一部分,例如该图像中显示的**细胞

荧光成像的另一个应用是荧光斑点显微镜技术,该技术使用荧光标记的大分子装配体(如此处看到的F-肌动蛋白网络)来研究这种重要细胞骨架蛋白的运动和更新动力学。

通过有意地对样品的一小部分进行光漂白,以监测荧光标记分子回到光漂白区域的扩散速率,可以执行一种称为光漂白后荧光恢复的先进技术,即FRAP。